当免疫细胞遇到入侵的病原体时，它们能迅速激活强大的防御机制。然而，过度的免疫反应可能会产生有害影响。免疫细胞在多个检查点受到各种分子和具有抑制功能的细胞的调节，这些检查点对于自我耐受的发展至关重要。然而，这样的检查点可能会被肿瘤和病原体劫持，从而逃离免疫系统的监视。
以PD-1和CTLA-4为靶点的肿瘤免疫疗法显著改善了不同癌症类型患者的预后，彻底改变了癌症治疗。这些治疗方法的成功证实了抑制性共受体是免疫细胞不攻击肿瘤细胞和自身组织的关键检查点。然而，它们的应答率通常较低，免疫相关不良事件（irAEs）也在使用免疫检查点抑制剂的患者中出现。这表明需要继续破译抑制性共受体的复杂生物学，以提高癌症患者的响应率并防止不必要的副作用。
迄今为止，除了PD-1和CTLA-4外，还发现了许多刺激性和抑制性的共受体。这些共受体通过调节抗原受体信号的质量和数量来控制淋巴细胞的活化，从而在避免自身免疫和过度免疫反应的同时优化针对肿瘤和病原体的免疫反应。在这些共受体中，淋巴细胞活化基因-3（LAG-3，CD223）是仅次于PD-1的首要靶点，目前正在进行多项临床试验来验证LAG-3靶向治疗作用。
LAG-3的分子特性
1990年，Triebel和他的同伴在一项筛选中发现了LAG-3。LAG-3是一种Ⅰ型跨膜蛋白，具有四个Ig样结构域，称为结构域1到结构域4（D1-D4）。LAG-3的胞外区与CD4的氨基酸同源性约为20%，CD4也由4个Ig样结构域组成。此外，在大多数物种中，LAG-3基因位于CD4基因附近，因此，这些基因很可能是通过基因复制进化而来的。与细胞外区域的相似性相反，LAG-3和CD4的细胞内区域没有明显的相似性。LAG-3缺乏与淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶（Lck）相关所需的半胱氨酸基序和在CD4中观察到的棕榈酰化位点。
LAG-3的D1由9条β-链组成，它们被称为A、B、C、C'、C”、D、E、F和G链。大约30个氨基酸的附加序列位于C和C'链之间，形成一个环，称为“额外环”。尽管序列相似性较低，但在人和小鼠LAG-3中都可以观察到这个环，据报道此环参与了LAG-3和主要组织相容性复合体II类（MHCII）之间的关联。此外，LAG-3高度糖基化，在D2-D4中存在多个N-糖基化位点。Galectin-3和肝窦内皮细胞凝集素（LSECtin）被认为与LAG-3聚糖存在相互作用。
与CD4相比，D4和跨膜区之间的LAG-3区有一个较长的氨基酸序列称为“连接肽”。基于小鼠模型，Li等报道了金属蛋白酶ADAM10和ADAM17在CP处裂解LAG-3，并以可溶性形式释放LAG-3胞外区域。LAG-3突变体能够逃避金属蛋白酶的切割，表现出更强的抑制作用。因此，ADAM10和ADAM17可能通过调节细胞表面LAG-3的数量来调节LAG-3的抑制作用。人与小鼠CP的氨基酸序列同源性较低。人类LAG-3是否也能被这些金属蛋白酶裂解，还有待进一步研究。目前，可溶性LAG-3的功能尚不清楚。
LAG-3的表达
与PD-1和CTLA-4一样，LAG-3在原始T细胞上不表达，但在抗原刺激下可在CD4+和CD8+T细胞上诱导表达。由于LAG-3的抑制功能与其在细胞表面的表达水平密切相关， LAG-3表达的调节非常关键。长期感染病毒、细菌、寄生虫引起抗原的持续暴露，会导致CD4+和CD8+T细胞上LAG-3以及其他抑制性共受体的高水平持续表达。这些T细胞失去强大的效应器功能，被称为衰竭性T细胞。LAG-3阻断剂已被证明能使衰竭的T细胞恢复活力并增强抗感染免疫，尽管与PD-1阻断剂相比，作用较小。肿瘤浸润性T细胞也持续暴露于肿瘤相关抗原，并表达高水平的多种抑制共受体，包括LAG-3，导致功能衰竭。IL-2、IL-7和IL-12可增强活化T细胞的LAG-3表达。
LAG-3在具有抑制功能的CD4+T细胞亚群中也有表达。Foxp3+调节性T（Treg）细胞结构性地表达LAG-3。Zhang等人证明，LAG-3对Treg细胞的增殖具有内在的限制作用。LAG-3在Treg细胞效应器功能中的作用是有争议的。Huang等人报告，LAG-3缺陷小鼠的Treg细胞以较低的效率抑制效应T细胞的激活，而其他研究表明，LAG-3缺陷Treg细胞的抑制功能是可比的。需要进一步的研究来阐明LAG-3与Treg细胞的实际作用。LAG-3在CD4+1型调节T细胞（Tr1）上也有表达，Tr1细胞通过分泌大量的IL-10表现出强大的免疫抑制活性。此外，表达LAG-3的CD4+CD25-Foxp3-T细胞产生IL-10和转化生长因子（TGF）-β3，被认为是一种独特的细胞群，具有调节功能。有趣的是，目前也观察到产生IL-10的自然调节浆细胞表达LAG-3，LAG-3在这些非经典调节细胞的细胞外抑制功能中的作用尚不清楚，需要进一步的研究。
已知多种转录调节因子，如胸腺细胞选择相关的高迁移率族蛋白盒（TOX）、活化T细胞核因子（NFAT）、核受体亚家族4A（NR4A）、干扰素调节因子4和B淋巴细胞诱导的成熟蛋白-1参与产生衰竭的T细胞。其中，NFAT、NR4A和TOX被证明在T细胞中过度表达时，与其他抑制性共受体一起，可以增加LAG-3的表达水平。早期生长反应基因2（EGR2）也被报道是诱导CD4+CD25-Foxp3-调节性T细胞中LAG-3表达的关键转录因子。另一方面，T细胞中表达的T-box（T-bet）被报道抑制LAG-3和其他抑制性共受体的表达，并维持慢性感染时CD8+T细胞的抗原特异性反应。除了转录调控外，LAG-3的细胞表面表达水平还受亚细胞转运和蛋白水解裂解的调节。
LAG-3在CD3+CD4-CD8-T细胞、TCRαβCD8αα上皮内淋巴细胞、γδT细胞和NKT细胞上也有表达，据报道，其在活化NK细胞上的表达参与了对小鼠MHCI阴性靶细胞的杀伤作用。浆细胞样树突状细胞和活化B细胞也在其细胞表面表达LAG-3。然而，LAG-3在这些细胞中的功能作用仍然知之甚少。此外，据报道LAG-3在神经元上也有表达，并作为α-突触核蛋白纤维的受体。
LAG-3的配体
最近，MHCII反式激活因子（CIITA）被确定为LAG-3配体的关键调节因子。CIITA不仅诱导MHCII表达，还诱导MHCII辅助分子表达，包括CD74和H2-DM。MHCII的辅助分子有助于肽MHCII复合物（pMHCII）的形成和细胞表面分类，在传统的抗原呈递途径中表现出稳定的结构构象。LAG-3区分pMHCII的构象并选择性地与稳定的pMHCII结合。因此，LAG-3优先抑制识别稳定pMHCII的CD4+T细胞的激活。此外，也已证明LAG-3不与CD4竞争pMHCII结合。相反，LAG-3通过通过细胞内区域传递抑制信号抑制T细胞激活。
LAG-3的配体
如前所述，LAG-3表达于肿瘤衰竭的CD8+T细胞上，是肿瘤免疫治疗的有效靶点。然而，LAG-3与pMHCII结合影响CD8+T细胞活化的机制尚未阐明。最近，研究发现当抗原提呈细胞除了表达同源的pMHCI外，还表达大量稳定的pMHCII时，CD8+T细胞的活化受到弱抑制，这表明LAG-3也可以在一定程度上直接抑制CD8+T细胞。
到目前为止，除了稳定的pMHCII外，还有其他几种分子被报道为LAG-3的可能配体。如前所述，galectin-3和LSECtin已被证明与LAG-3上的聚糖相互作用。Galectin-3属于Galectin家族，是一种由多种肿瘤细胞和肿瘤间质细胞分泌的可溶性半乳糖结合凝集素。LSECtin是C型凝集素家族的一员，主要在肝脏中表达。研究报道，在表达LSECtin的黑色素瘤细胞中，LAG-3抑制T细胞在抗CD3抗体刺激下产生IFN-γ。最近，Wang等人发现纤维蛋白原样蛋白1（FGL1）是LAG-3的潜在配体。FGL1在正常生理条件下由肝细胞分泌，而一些肿瘤细胞也能高水平地产生FGL1。FGL1被证明可以使表达LAG-3的3A9 T杂交瘤细胞减少IL-2的分泌。还需要进一步的研究来阐明这些潜在配体是否以及如何独立和/或协同地参与LAG-3的抑制功能。
除了免疫抑制作用外，LAG-3似乎在神经系统中也有明显的作用。Mao等人报道LAG-3可以与α-突触核蛋白纤维结合，这与帕金森病的发病机制有关。α-突触核蛋白纤维与LAG-3的结合触发了α-突触核蛋白纤维的内吞作用、细胞间传递和神经毒性。
LAG-3的抑制机制
LAG-3的胞内区由大约60个氨基酸残基组成，缺乏典型的抑制基序，如免疫受体基于酪氨酸的抑制基序。然而，它包含几个氨基酸序列，这些氨基酸序列在不同的LAG-3物种中非常保守，而不与其他抑制性共受体共享。这些序列包括并列膜区的FSAL，中部区域的KIEELE，10-15个谷氨酸串联重复序列，以及在C末端区域的倾向但不限于的脯氨酸（EX-repeat）。LAG-3抑制T细胞活化需要细胞内区域的信号传递，它可以通过这些序列传递不同的抑制信号。
LAG-3的抑制功能与其在细胞表面的表达水平密切相关，当评估小鼠LAG-3突变体在DO11.10t杂交瘤细胞抗原依赖性激活中的表达水平时，氨基酸替换和缺失对LAG-3的表达水平有显著影响，FSAL序列中苯丙氨酸和亮氨酸被丙氨酸取代后，LAG-3的抑制能力显著降低。此外，当FSAL序列的突变与EX-repeat的缺失相结合时，LAG-3的抑制能力完全丧失，相当于缺少了整个细胞内区域。有趣的是，EX-repeat的缺失并不影响LAG-3的抑制能力。这些结果表明LAG-3可能通过FSAL基序和EX-repeat转导两个独立的抑制信号，然而这些信号的分子机制仍不清楚。进一步的分析有望描绘出这些基序独立或协同调节T细胞活化信号通路的精确分子机制。
LAG-3在自身免疫中的作用
抑制性共受体在建立和/或维持自身免疫耐受中起着关键作用，其表现为PD-1和CTLA-4缺陷小鼠自发的自身免疫性疾病，靶向PD-1和CTLA-4的免疫检查点抑制剂不仅激活肿瘤特异性T细胞，还激活自身反应性T细胞，以诱导组织毒性，称为irAEs。与PD-1和CTLA-4不同，LAG-3缺陷本身不会导致非自身免疫倾向小鼠的自身免疫。然而，在非肥胖糖尿病（NOD）小鼠中，LAG-3的基因缺失或阻断会加重1型糖尿病（T1D）。LAG-3缺陷NOD小鼠与年龄匹配的LAG-3丰富的NOD小鼠相比，胰岛中自身反应性CD4+和CD8+T细胞加速浸润。此外，LAG-3和PD-1复合缺陷小鼠会发生致命性自身免疫性心肌炎，表明LAG-3与PD-1协同作用，以预防自身免疫。
在实验性自身免疫模型中，LAG-3被报道可以减轻自身免疫症状。Jha等报道LAG-3缺乏或阻断通过抑制C57BL/6.H2s小鼠对汞的耐受性，增加了对汞诱导的自身免疫的易感性。在髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型中，kadovaki等人证明LAG-3阻断剂消除了肠道环境诱导的上皮内MOG特异性CD4+T细胞的抗炎作用。Kim等还报道了体外诱导的Treg（iTreg）细胞拯救Treg耗竭小鼠致死EAE的能力依赖于iTreg细胞上LAG-3的表达。
鉴于LAG-3在自身免疫中的重要调节作用，LAG-3有望成为炎症和自身免疫性疾病的治疗靶点。已开发出具有ADCC活性的人源化抗LAG-3抗体（GSK2831781），通过清除可能包括致病性自身反应性T细胞的LAG-3+T细胞来治疗自身免疫性疾病。此外，抗LAG-3激动剂抗体（IMP761）通过诱导LAG-3的抑制作用，在体内外均有免疫抑制作用。
LAG-3在抗肿瘤免疫中的作用
如前所述，LAG-3在衰竭的CD4+和CD8+肿瘤浸润性T细胞上表达，这些T细胞在黑色素瘤、结直肠癌患者的外周血和肿瘤组织中也有表达，这种表达LAG-3的Treg细胞产生高水平的免疫调节细胞因子IL-10和TGF-β，并抑制肿瘤特异性T细胞。一直以来，肿瘤中LAG-3表达水平和LAG-3+细胞浸润与肿瘤进展、预后不良和各种类型的人类肿瘤相关。这些结果强烈表明，LAG-3参与了类似PD-1的肿瘤免疫逃逸机制。因此，LAG-3被认为是肿瘤免疫治疗的一个有前途的治疗靶点，动物模型的研究也证实了这一点。抗LAG-3抗体延缓肿瘤生长的研究已在HNSCC和纤维肉瘤的小鼠模型中被报道。Grosso等人证明，结合抗LAG-3抗体和接种肿瘤相关抗原的组合疗法增加了肿瘤中活化的CD8+T细胞的数量，并在前列腺癌的肿瘤耐受模型中破坏了肿瘤实质。然而，在联合治疗或单独接种的小鼠之间，肿瘤等级没有显著差异。
LAG-3与PD-1协同抑制抗肿瘤免疫和自身免疫。在上皮性卵巢癌患者中，Matsuzaki等人观察到大约80%佛如LAG-3+和50%的LAG-3-肿瘤浸润CD8+T细胞表达PD-1。他们还报道了LAG-3和PD-1的联合阻断增强了肿瘤相关抗原NY-ESO-1体外刺激肿瘤浸润的CD8+T细胞的增殖和细胞因子的产生。在B16黑色素瘤、MC38结肠腺癌、Sa1N纤维肉瘤和复发性黑素瘤等多种肿瘤模型中也观察到LAG-3和PD-1在肿瘤浸润的CD4+、CD8+T细胞上的共表达以及LAG-3和PD-1基因复合缺失的强治疗作用。尽管LAG-3阻断剂有望激活肿瘤特异性CD4+和/或CD8+T细胞，但它也可能增加Treg细胞的数量，LAG-3被报道可以限制Treg细胞的增殖。根据Goding等人的研究，在复发性黑色素瘤模型中，Treg细胞被LAG-3和PD-1共同阻断而减少。还需要进一步的研究来阐明LAG-3对Treg细胞和效应T细胞数量和功能的确切影响。
在这些研究中，抗LAG-3ab作为单药治疗时产生了一定的治疗效果，但显著增强了抗PD-1抗体的治疗效果。这两种分子的抑制机制和/或表达谱的差异很可能解释了它们的功能协同作用。LAG-3与PD-1协同或加性作用的确切机制尚需进一步研究。
LAG-3的临床开发
基于临床前的观察，尤其是与针对PD-1的药物联合使用带来的益处。到目前为止，已经开发出至少13种针对LAG-3的药物。包括抗LAG-3阻断性抗体（relatlimab（BMS-986016）、Sym022、TSR-033、REGN3767、LAG525、INCAGN2385-101、MK-4280和BI754111）以及拮抗双特异性抗体（MGD013（抗PD-1/LAG-3）、FS118（Anti-LAG-3/PD-L1）和XmAb22841 (anti-CTLA-4/LAG-3))。
到目前为止，只有少数针对LAG-3和PD-1的组合疗法的中期报告。抗LAG-3抗体作为单药治疗的实际疗效或抗LAG-3抗体在PD-1和LAG-3联合治疗中的确切加性效应有待进一步的报道。在I/II期研究中（NCT0198609），评估了relatlimab联合抗PD-1抗体（nivolumab）治疗晚期黑色素瘤患者的安全性和有效性，这些患者在先前的抗PD-1或抗PD-L1免疫治疗中有进展，relatlimab与nivolumab联合应用耐受性良好，61例患者的客观缓解率（ORR）为11.5%。肿瘤边缘内至少1%的肿瘤相关免疫细胞中LAG-3表达的患者（n=33）的ORR至少比LAG-3表达低于1%的患者（n=22）高3.5倍（分别为18%和5%）。在I/II期研究（NCT02460224）中，LAG525联合抗PD-1抗体（spartalizumab）在9.9%的患者中（n=121）表现出持久的反应，包括间皮瘤（8例患者中的2例）和三阴性乳腺癌（5例中有2例）。这种抗LAG-3抗体的确切作用机制仍有待研究。尤其是对抗LAG-3治疗中靶细胞的检测以及阐明抗LAG-3和抗PD-1治疗协同作用的机制，是合理设计疗效最大、副作用最小的抗LAG-3治疗方案所必需的。
其他LAG-3靶向药物也被用于癌症治疗。IMP321是一种可溶性重组融合蛋白，由LAG-3的胞外区和IgG的Fc区组成，通过MHCII介导反向信号激活抗原提呈细胞，导致IL-12和TNF的增加，CD80和CD86的上调。在目前进行的临床试验中，IMP321单药治疗或与其他疗法联合治疗的疗效一般。通过MHCII反向信号的细节仍然未知，需要仔细研究。
抗-LAG-3消耗抗体（GSK2831781）和激动剂抗体（IMP761）作为治疗自身免疫性疾病的潜在治疗剂也有报道。尽管这些抗体旨在清除或抑制致病性T细胞，但它们也可能消耗或抑制Treg细胞。进一步的研究阐明这种抗体的功能以及LAG-3的生物学特性有望促进其发展。
展望
靶向抑制性协同受体PD-1和CTLA-4的检查点免疫疗法彻底改变了癌症治疗，而LAG-3作为新一代发现的抑制性检查点，有望成为肿瘤治疗中极具前景的靶点。然而，我们对LAG-3的理解仍然非常有限，许多基本问题仍然没有得到解答。LAG-3的信号转导机制尚不清楚，其配体也很复杂。LAG-3在多种细胞中表达，然而，LAG-3的功能以及LAG-3阻断剂在每种类型细胞中的作用尚未阐明。我们还需要研究LAG-3和其他共受体的功能差异、冗余和协同作用。通过更详细地阐明LAG-3的功能特性，我们才可以合理地设计LAG-3靶向治疗各种疾病，如癌症和自身免疫疾病。
参考文献：
1. LAG-3: from molecular functions to clinical applications. J Immunother Cancer. 2020 Sep;8(2):e001014.
2. clinicaltrials.gov